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PCR实验室的核心问题是什么?

发布时间2019-10-08        浏览次数:116

    PCR实验室原则上分为四个单独的工作区域:试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区。为避免交叉污染,进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行,从试剂准备区→标本制备区→扩增区→产物分析区单向流动。

    实验室空调通风系统设计及压力控制是PCR实验室的重中之重,虽然PCR实验室没有严格的空气洁净度要求,但是为避免各个功能区之间交叉污染的可能性,应采用独立送风、全送全排的气流组织形式,并保证各功能区的压力梯度要求。各功能区的压力梯度要求如下:

    试剂准备区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于样品制作的材料应直接运送至该区,不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。

    标本制备区主要进行的操作为样本的保存、核酸(RNADNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定DNA的合成。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为正压,以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外,由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染,所以应避免在本区内不必要的走动。

    扩增区,已制备的DNA模板 (来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为负压,以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染,应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。

    产物分析区主要进行的操作为扩增片段的测定。本区是zui主要的扩增产物污染来源,因此对本区的压力梯度的要求为:相对于邻近区域为负压,以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。

    PCR实验室的核心问题是如何避免污染,由于一旦发生污染,实验就必须停止,直到找到污染源为止,而且实验结果必须作废,需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐,浪费人力物力。PCR实验室常见有扩增产物的污染;天然基因组DNA的污染;试剂的污染以及标本间的污染等。因此要避免污染,事前预防是关键。

    专业的设计是避免污染的源头,首先应做到各个功能区域科学合理布置;各个功能区域要有明显的标记(如醒目的门牌或不同的地面颜色等),以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。

    其次应具备合理的空调通风系统设置,尽量采用独立送风、全送全排的空调系统;严格的压力梯度控制、缓冲、门开启关闭互锁,以确保“不串风”。

 





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